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1、引物設(shè)計(jì)：獲得彎曲菌的16srRNA基因，空腸彎曲菌mapA基因，結(jié)腸彎曲菌ask基因和胎兒彎曲菌cstA基因的特異性序列，基于軟件Primer5.0工具設(shè)計(jì)引物。

2、細(xì)菌基因組DNA的提取

制備空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、胎兒彎曲菌的 DNA 模板。在準(zhǔn)備的 CCDA 平板上接種，42℃ 微需氧環(huán)境下培養(yǎng)二天后選擇5個(gè)菌落，加入到 0.1mL滅菌去離子三蒸水(SW)中且充分吹打均勻，沸水煮10min，取出后放置在冰上，8000r/min高速離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到-20℃條件下保存，取菌株 DNA 進(jìn)行特異性及靈敏度檢測(cè)。

3、多重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

PCR體系(20μL)中各成分的量如下：2xTaqMastermix10μL，引物各1μL，DNA模板溶液2μL，按要求加入后離心15s，收集反應(yīng)物后進(jìn)行擴(kuò)增。

對(duì)體系最適退火溫度進(jìn)行摸索，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃15min，95℃30s，50-60℃(8個(gè)梯度進(jìn)行梯度PCR)90s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃低溫條件下保存。

電泳鑒定：根據(jù)分子量大小配制1.0%瓊脂糖溶液，然后取出其中8μL擴(kuò)增所得產(chǎn)物點(diǎn)樣，以 DNAMarkerDL2000 作對(duì)照，100V 恒壓電泳 40min后取出凝膠，通過(guò)凝膠成像軟件觀察結(jié)果。

4、多重 PCR 特異性檢測(cè)

使用建立的PCR體系對(duì)空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、胎兒彎曲菌以及大腸桿菌、沙門氏菌等 11株參考菌株進(jìn)行檢測(cè)分析，凝膠電泳后 UV成像觀察并對(duì)擴(kuò)增情況進(jìn)行分析。

5、多重 PCR 靈敏度檢測(cè)

通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和胎兒彎曲菌的 DNA 抽提液，且據(jù)此測(cè)定 DNA 含量，進(jìn)行 10倍梯度稀釋處理，獲得系列梯度稀釋液，各取2μL 分別進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)條帶亮度進(jìn)行觀察，直到不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶為止。