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布魯氏菌試管凝集試驗：

1897年萊特氏等（Wright）與其同事發(fā)現(xiàn)患該病的病人血清與馬爾他細(xì)菌的培養(yǎng)物產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象，遂稱之為萊特氏凝集反應(yīng)，成了迄今常用的血清學(xué)診斷方法之一。

設(shè)備及試劑：試管凝集抗原、被檢血清、0.5%的石碳酸生理鹽水、吸管、試管、試管架、孵箱

操作步驟：

被檢血清的稀釋：一般情況下，每份血清用5支小試管，第一管加入2.3ml石碳酸生理鹽水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5ml，用1ml吸管吸取被檢血清0.2ml，加入第一管中，混勻?；靹蚝螅栽撐芪〉谝还苤醒寮尤氲诙偷谌芨?/span>0.5ml，以該吸管將第三管混勻，并吸取0.5ml加入第四管，依次稀釋到第五管，混勻后，從第五管吸出0.5ml棄去，如此稀釋后，從第二管起血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50、1：100.

加入抗原：先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當(dāng)稀釋，（一般是作1：10稀釋），稀釋后的抗原加入各稀釋的血清管（第一管不加，作為血清對照），每管0.5ml，混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1ml，從第二管起血清稀釋度分別為1：25、1：50、1：100、1：200，從第一管再吸出0.5ml，剩1ml。

對照管的操作：

抗原對照：（適當(dāng)稀釋的抗原加石碳酸鹽水）

被檢血清對照

陰性對照（陰性血清稀釋后加抗原）

陽性對照（陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）

然后將試驗管和對照管充分混勻后，放于37℃溫箱中20-22小時后取出，在室溫下放置2個小時，以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

結(jié)果判定：

判定比濁管的制備：每次試驗須配置比濁管作為判定的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

配制方法是：取本次試驗用的抗原稀釋液（一般1：10）5-10ml，加入等量的0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管。

試管凝集反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)比濁管配制：

結(jié)果記錄：

根據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結(jié)果，特別是50%清亮度（++）對判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對比判定。

血清對照為清亮透明無沉淀，抗原對照為均勻渾濁在兩種對照管都成立的情況下，才可判定試驗管，否則應(yīng)重做。對沉淀需要經(jīng)驗判定。

“++++”：完全凝集，上清液100%清亮；

“+++”：幾乎完全凝集，上清液75%清亮；

“++”：顯著凝集，上清液50%清亮；

“+”：微量凝集，液體25%清亮；

“-”：無凝集，液體不清亮。

確定每份血清滴度是以出現(xiàn)“++”及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：

沒有進(jìn)行過菌苗接種的人、畜血清試驗的標(biāo)準(zhǔn)是：人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：100（++）及以上者為陽性，1：50（++）為可疑；

豬、羊（綿羊、山羊）、犬等小家畜血清在1：50（++）及以上者為陽性，1：25（++）為可疑；

對可疑反應(yīng)的人和動物應(yīng)在10-25天內(nèi)重復(fù)檢查，以便進(jìn)一步確定診斷。

影響試驗結(jié)果的因素及注意事項：

1、受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10℃，采血后應(yīng)于3-4日內(nèi)進(jìn)行檢查，因放置時間過長可能會導(dǎo)致血清效價降低。

2、遵守操作規(guī)程：作用的器材要清潔、干燥，試劑的加量一定要正確，放入溫箱的溫度和時間都要按要求，否則都影響結(jié)果，每份血清和抗原均要有對照。

3、高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在10-12%，一般切記人血清不能用高滲鹽水。

4、作凝集反應(yīng)時，有個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低的血清管內(nèi)（或血清量多的格）不發(fā)生凝集，而稀釋度高的管內(nèi)（或血清量少的格）出現(xiàn)凝集，這叫做前帶現(xiàn)象，如果某血清在平板凝集反應(yīng)中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反應(yīng)時應(yīng)多做幾個管，多采用幾個稀釋度。

5、氯化鈉的含量增高對血清反應(yīng)有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應(yīng)的敏感性提高，因此在獸醫(yī)界為了客服凝集反應(yīng)中的阻抑抗體的干擾，對羊血清采用高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在10-12%，切記一般人血清不能用高滲鹽水。

6、前帶現(xiàn)象產(chǎn)生的原因：①膠體粒子學(xué)說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結(jié)合，而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝集。②不完全抗體學(xué)說：血清中因存在不完全抗體競爭抗原，所以在低稀釋度的管中不凝集。③抗原抗體比例失調(diào)，也就是抗體過?；蜓鍍?nèi)含有過多防腐劑，嚴(yán)重污染可造成前帶現(xiàn)象的產(chǎn)生，封閉抗原的干擾。

評價：

該方法特異性較好，敏感性也高，因此適用于檢疫和臨床診斷。

由于該試驗有時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象和封閉現(xiàn)象，所以有時也出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時和其他方法聯(lián)合應(yīng)用。

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