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實驗菌種：金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC15442、大腸桿菌8099、枯草桿菌黑色變種芽胞ATCC9372、白色葡萄球菌8032，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗特殊需要，還可增選其他菌株。

1、細(xì)菌繁殖體懸液的制備

①以無菌操作方式開啟菌種管，用毛細(xì)吸管加人適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5.0 mL~10.0 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 36 ℃士1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置 36 ℃士1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h?；驈木N保存管中取出一粒菌珠接種于平皿上，置 36 ℃士1℃培養(yǎng) 18 h~24 h，挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置 36 ℃士1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h，即為第3代培養(yǎng)物。

②取第3代~第8代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng) 18 h~24h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 mL~5.0 ml,稀釋液(一般用 TPS酸化水用生理鹽水)加人試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0 mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，用電動混勻器混合 20s或在手掌上振打 80 次，以使細(xì)菌懸浮均勻。

③初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需濃度。

④細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4℃ 冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當(dāng)天使用，不得過夜。

⑤懷疑有污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等法進(jìn)行鑒定。

2、細(xì)菌芽胞懸液的制備

①以無菌操作方式開啟菌種管，用毛細(xì)吸管加人適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5.0 mL~10.0 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置 36 ℃士1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h，挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置 36 ℃士1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h，即為第 3代培養(yǎng)物。

②用 10.0 ml吸管吸取 5.0 mL~10.0 mL第3代~第5代的 18 h~24h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置 36 ℃士1 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 5 d~7 d。用接種環(huán)取菌苔少許涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。

改良芽胞染色法步驟如下：a)用接種環(huán)取菌苔涂布于玻片上，待自然干燥，而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。b) 將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 5.00%孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放 54 ℃~56 ℃條件下加熱 30 min。取出，去濾紙，用自來水沖去殘留液。加 0.5%沙黃水溶液，染1 min。水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。并在顯微鏡(油鏡)下進(jìn)行鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達(dá) 90%以上時，即可進(jìn)行后續(xù)處理。否則，應(yīng)繼續(xù)在室溫下放置一定時間，直至達(dá)到上述芽胞形成率后再進(jìn)行以下處理。

③加 10.0 ml無菌蒸餾水于羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL無菌蒸餾水沖洗培養(yǎng)基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中，振搖5 min。將燒瓶置 45 ℃水浴中 24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽胞。用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液，清除瓊脂凝塊。

④將芽胞懸液置無菌離心管內(nèi)，以 3000 r/min 速度離心 30 min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮，本步驟重復(fù)3遍。將洗凈的芽胞懸液放人含適量小玻璃珠的燒瓶內(nèi)，80 ℃水浴10 min(或 60 ℃水浴 30 min)，以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝保存于4℃冰箱中備用。有效使用期半年。

⑤芽胞懸液在使用時，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計數(shù)。懷疑有雜菌污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等方法進(jìn)行鑒定。