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（五）染料抑菌試驗(yàn)

1、原理：不同種型布魯氏菌對(duì)某些染料活躍的還原系統(tǒng)表現(xiàn)出不同的還原能力，在一定濃度不同染料環(huán)境中可生長(zhǎng)或被抑制，因此,可根據(jù)不同染料對(duì)不同種型布魯氏菌抑制情況作為種型鑒定依據(jù)。

2、試驗(yàn)材料、試劑制備

3、(1)硫堇、堿性復(fù)紅基礎(chǔ)液配制:

稱取硫堇和堿性復(fù)紅各0.1g,分別放入研磨缽中仔細(xì)研磨,然后加少許無水乙醇再仔細(xì)研磨。每種顏料共加無水乙醇20ml,把顏料分別洗人棕色瓶中,塞緊瓶塞,室溫下放置2~3天,每天振搖數(shù)次,使顏料充分溶解,然后各瓶加蒸餾水至100ml,充分混 勻。  即為1:1000的硫堇和1:1000的堿性復(fù)紅溶液。將一定數(shù)量直徑5mm高壓滅菌的濾紙片放在盛有硫堇和堿性復(fù)紅基礎(chǔ)液中浸泡2天后取出,在滅菌的平皿中分散攤開,置37℃溫箱中烤干收取備用。置4℃冰箱保存?zhèn)溆?可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。

注:每個(gè)廠家的染料所用濃度可能會(huì)不同,所以制好的濾紙片應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行檢測(cè)后方可使用。

(2)布氏肉湯半固體培養(yǎng)基配制

布氏肉湯培養(yǎng)基(生產(chǎn)商:BD):28g、瓊脂粉:7g、蒸餾水:1000ml，煮沸使瓊脂充分融解,分裝玻璃試管,根據(jù)使用平皿大小確定分裝量,一般實(shí)驗(yàn)使用 90mm 規(guī)格的平皿可分裝10m1的量,高壓滅菌后保存?zhèn)溆谩?/span>

4、操作方法：

  (1)在布氏瓊脂平皿底面分區(qū)標(biāo)記硫革、復(fù)紅

  (2)融化布氏肉湯半固體培養(yǎng)基,置于50℃水浴中備用；

  (3)使用移液器吸2m1生理鹽水移至5m1Felcon管,用接種環(huán)分別挑取適量24~48小時(shí)的培養(yǎng)物至Felcon管,在管壁研磨,用混旋器混勻,制備菌懸液10億菌體/m1(麥?zhǔn)蠞岫?1.4),用記號(hào)筆在Felcon管標(biāo)記菌株名稱。

  (4)使用移液器吸取100uL菌懸液,加入到50℃水浴的半固體培養(yǎng)基中混勻,將混勻后的菌懸液-半固體培養(yǎng)基倒入布氏瓊脂培養(yǎng)基平皿中鋪平,待其凝固。

  (5)分別將硫革、復(fù)紅染料濾紙片輕放在凝固后相應(yīng)標(biāo)記的雙層培養(yǎng)基表面,放培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng),24~48 小時(shí)后觀察結(jié)果。

5、結(jié)果判定：

細(xì)菌生長(zhǎng)受到染料抑制時(shí),染料濾紙的周圍無菌生長(zhǎng),判定為陰性。細(xì)菌生長(zhǎng)不受染料抑制時(shí),染料濾紙的周圍有菌生長(zhǎng),判定為陽(yáng)性。