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1.熒光光譜儀簡介

  熒光光譜儀又稱熒光分光光度計(jì)，是一種檢測物質(zhì)的定性、定量分析儀器。 其原理是根據(jù)熒光效應(yīng)：激光照射原子，原子中電子吸收能量躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)， 但這些激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會以光的形式釋放 ，產(chǎn)生熒光，一般持續(xù)發(fā)光時(shí)間短于10^-8秒（同時(shí)產(chǎn)生的磷光持續(xù)時(shí)間大于10^-8秒）。 通過熒光光譜儀的檢測，可以獲得物質(zhì)的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率、熒光強(qiáng)度、熒光壽命、斯托克斯位移、熒光偏振與去偏振特性，以及熒光的淬滅方面的信息。熒光光譜分析技術(shù)常應(yīng)用于生物研究、制藥分析、化工分析、食品檢測、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測、礦物分析等。

2.熒光光譜儀分類

按熒光原理可分：原子熒光光譜儀、分子熒光光譜儀和X射線熒光光譜儀等。

• 原子熒光光譜儀是通過測量待測元素的原子蒸氣在輻射能激發(fā)下所產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度,來測定待測元素含量的儀器。原子熒光激發(fā)光源一般為高強(qiáng)度空心陰極燈或無極放電燈一般原子熒光光度計(jì)用來對各類樣品中痕量的鉛、汞、砷、鍺、錫、硒、碲、鉍、銻、鋅、鎘的等無機(jī)元素定性和定量分析，通常用于環(huán)境監(jiān)測，礦物鑒定等 。

• 分子熒光光譜儀是利用某些物質(zhì)被紫外光或可見光照射后所產(chǎn)生的,并且能夠反映出該物質(zhì)特性的熒光,對其進(jìn)行定性和定量的分析。分子熒光激發(fā)光源一般為是氙燈或高壓汞燈。一般用來測定主要是含有共軛不飽和體系的化合物，如含有機(jī)分子的物質(zhì)，通常用生物醫(yī)學(xué)研究，制藥，化工等領(lǐng)域。

• X射線熒光光譜儀的發(fā)射源是Rh靶X光管，有兩種基本類型：波長色散型（WD-XRF）和能量色散型（ED-XRF）。其主要用于金屬元素的測定，在環(huán)境科學(xué)、高純物質(zhì)、礦物、水質(zhì)監(jiān)控、生物制品和醫(yī)學(xué)分析等方面有廣泛的應(yīng)用。

  通用熒光光譜儀根據(jù)波長范圍大致可分為3種：

• 基本型：在200-800 nm的紫外可見波段的穩(wěn)態(tài)光譜儀。

• 擴(kuò)展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見-近紅外穩(wěn)態(tài)光譜儀。

• 綜合型：覆蓋上述兩個(gè)波段，同時(shí)可測瞬態(tài)光譜的光譜儀。

3.熒光光譜儀先進(jìn)分析方法（關(guān)系到配套軟件）

• 同步熒光分析。它與常用熒光測定最大的區(qū)別是同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長，由測得的熒光強(qiáng)度信號與對應(yīng)的激發(fā)波長(或發(fā)射波長)構(gòu)成光譜圖，即同步熒光光譜。步熒光分析具有光譜簡單，譜帶窄、分辨率高、光譜重疊少等優(yōu)點(diǎn)，可提高選擇性，減少散射光等的影響，非常適合多組分混合物的分析，在環(huán)境、藥物、臨床、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

• 偏振熒光分析。熒光體的熒光偏振與熒光各向異性值的測定，能夠提供與熒光體在激發(fā)態(tài)壽命期間動力學(xué)相關(guān)的信息，因此熒光偏振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究分子間的作用，例如蛋白質(zhì)與核酸、抗原與抗體、蛋白質(zhì)與多肽的結(jié)合作用等。

• 三維熒光分析。普通熒光分析所得的光譜是二維譜圖，而描述熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)和發(fā)射波長變化的關(guān)系譜圖，就是三維熒光光譜。它可以提供比常規(guī)熒光光譜和同步熒光光譜更為完整的光譜信息，是很有價(jià)值的光譜指紋技術(shù)。三維熒光光譜可以作為光譜指紋技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測(溶解有機(jī)質(zhì)的分布等)、臨床化學(xué)(根據(jù)癌細(xì)胞熒光代謝產(chǎn)物的檢測，區(qū)分癌與非癌細(xì)胞等)以及細(xì)菌鑒別等領(lǐng)域應(yīng)用；也可用于光化學(xué)反應(yīng)監(jiān)測、多組分混合物的定性和定量分析等。

• 時(shí)間分辨熒光分析。由于不同分子的熒光壽命不同，可在激發(fā)與檢測之間延緩一段時(shí)間，使具有不同熒光壽命的物質(zhì)得以分別檢測，即時(shí)間分辨熒光分析。采用激光光源可以獲得皮秒(ps)級的脈沖寬度，可用于測定大多數(shù)熒光物質(zhì)的壽命，非常有助于生物大分子和基團(tuán)作用的研究。該技術(shù)與熒光免疫分析結(jié)合形成了時(shí)間分辨熒光免疫分析法。

• 低溫?zé)晒夥治?。通常熒光分析都在室溫下進(jìn)行，熒光光譜為帶光譜，由于自然界有許多有機(jī)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)頗為接近，它們的光譜往往相互重疊，難以鑒別表征以及定量測定。隨著溫度的降低，介質(zhì)黏度增大，熒光分子量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度將增大。因此，在低溫以及特殊條件下，熒光物質(zhì)就能給出更易識別的的尖銳熒光光譜(“準(zhǔn)線性光譜”)。這就有可能對樣品中所含熒光體進(jìn)行“指紋識別”，甚至有可能對混合物中某些特定組分進(jìn)行定量測定。低溫?zé)晒夥治隹捎糜诙喹h(huán)芳烴及衍生物的鑒別與定量、DNA加合物的分析等。

• 單分子熒光檢測。單分子熒光分析是實(shí)現(xiàn)單分子檢測最靈敏的光分析技術(shù)。單分子熒光檢測的關(guān)鍵在于確保被照射的體積中只有一個(gè)分子與激光發(fā)生作用以及消除雜質(zhì)熒光的背景干擾。單分子熒光檢測可提供單分子水平上生物分子反應(yīng)的動力學(xué)信息，分子構(gòu)象以及構(gòu)象隨時(shí)間的變化，因此尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，為生命科學(xué)提供了新的研究手段。

4.分子熒光光譜儀的優(yōu)劣勢

分子熒光光譜儀優(yōu)勢

• 制樣簡單，試樣多數(shù)不需經(jīng)過化學(xué)處理就可分析，且固體、液體試樣均可直接分析。

• 分析速度快。雖然測定用時(shí)與測定精密度有關(guān)，但一般都很短，2～5分鐘就可以測完樣品中的全部待測元素。

• 多元素同時(shí)檢出能力。可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中的多種元素。一個(gè)樣品一經(jīng)激發(fā)，樣品中各元素都各自發(fā)射出其特征譜線，可以進(jìn)行分別檢測而同時(shí)測定多種元素。

• 敏感度高，選擇性好。熒光分析的靈敏度要比吸收光譜測量高2-3個(gè)數(shù)量級。分光光度法通常在 10-7 級 ，而熒光的靈敏度達(dá)10-9。

• 非破壞分析。在測定中不會引起化學(xué)狀態(tài)的改變，也不會出現(xiàn)試樣飛散現(xiàn)象。同一試樣可反復(fù)多次測量，結(jié)果重現(xiàn)性好。

分子熒光光譜儀劣勢

• 在經(jīng)典分析中，影響譜線強(qiáng)度的因素較多，尤其是試樣組份帶來的光譜重疊等，所以對標(biāo)準(zhǔn)參比的組份要求較高。

• 難于作絕對定量分析,需要精確的標(biāo)樣做比較。含量（濃度）較大時(shí)，準(zhǔn)確度較差。

• 對樣品化合物有共軛性要求,應(yīng)用不廣泛.

5.分子熒光光譜核心技術(shù)

• 光源：由于熒光樣品的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比，因此，作為一種理想的激發(fā)光源應(yīng)具備：足夠的強(qiáng)度、在所需光譜范圍內(nèi)有連續(xù)的光譜、強(qiáng)度與波長無關(guān)(即光源的輸出是連續(xù)平滑等強(qiáng)度的輻射)、穩(wěn)定的光強(qiáng)。常用的光源主要有氙燈，激光器等。

• 探測器： 熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度。一般采用光電倍增管(PMT，如單光子技術(shù)，常見于高端)， CCD（中低端）和二級陣列管等（低端）。

• 分光系統(tǒng)（棱鏡/光柵）：熒光光譜儀中單色器一般為光柵或?yàn)V光片，需要兩個(gè)，一個(gè)用于選擇激發(fā)光波長(激發(fā)單色器)，一個(gè)用于分離選擇熒光發(fā)射波長(發(fā)射單色器)。

• 整體設(shè)計(jì)：如防止光電干擾光路和電路系統(tǒng)設(shè)計(jì)，模塊化可升級設(shè)計(jì)，樣品池開放性設(shè)計(jì)，配套軟件等

6.分子熒光光譜關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)

• 熒光光譜儀的光譜分辨率。光譜分辨率是指把光譜特征、譜帶分解成為分離成分的能力。高級的熒光光譜儀分辨率可達(dá)0.5～1nm。

• 熒光光譜儀的頻譜范圍。高級的熒光光譜儀可覆蓋200nm～1500nm。

• 熒光光譜儀中的波長準(zhǔn)確度和波長重復(fù)性。波長準(zhǔn)確度，是指波長的實(shí)際測定值與理論值(真值)的差，高端儀器的波長準(zhǔn)確度可達(dá)0.1nm。波長重復(fù)性與波長準(zhǔn)確度一樣重要，是光譜儀可靠性的標(biāo)志，高端的儀器可達(dá)0.1nm。

• 熒光光譜儀中的信噪比(S/N)。 一般水的拉曼S/N測試方法是把體系的靈敏度(信號存在)和體系噪音(信號不存在)的數(shù)據(jù)同時(shí)獲取并進(jìn)行比較，顯示了儀器的綜合性能。較好的拉曼S/N可達(dá)6000：1。

7. 影響分子光譜儀技術(shù)指標(biāo)的關(guān)鍵因素

• 光源 ：熒光強(qiáng)度基本隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)，因此，高能閃爍氙燈的使用大大提高了靈敏度。脈沖氙燈只在測量時(shí)閃爍，一方面延長了燈的壽命，另一方 面避免了連續(xù)光源長時(shí)間照射引起的光敏樣品的光降解和生物 樣品。

• 探測器：PMT光電倍增管信噪比大，每個(gè)通道只能讀取分立式譜，靈敏度高，疲勞恢復(fù)快。CCD面陣式檢測噪音低，信號同步測定，可以讀出一段光譜區(qū)域內(nèi)的連續(xù)光譜CCD，但CCD在響應(yīng)速度、溫度穩(wěn)定性等方面卻不如PMT。一般以PMT為探測器的光譜儀價(jià)格高于CCD光譜儀，常見于以單光子技術(shù)為基礎(chǔ)的高端儀器。

• 分光系統(tǒng) （棱鏡單色器/光柵單色器）,一般光柵單色器分辨率較高。另外,分光系統(tǒng)的中的狹縫，是影響分辨率和控制色散的關(guān)鍵因素。優(yōu)秀的光譜儀如PE，激發(fā)狹縫為2.5nm，步進(jìn)為0.1nm。但狹縫也需要和整個(gè)系統(tǒng)匹配，如果狹縫小到嚴(yán)重影響該光電響應(yīng)的靈敏度，也就導(dǎo)致光子信號太弱而無法形成有效光譜。

• 樣品池, 熒光儀用的樣品池需用低熒光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形狀以方形和長方形為宜。

• 樣品本身，如化合物組合的復(fù)雜程度，共軛分子間元素和形態(tài)相似性等，還有溶液的PH值，溫度等。

• 非線性：熒光發(fā)射與吸收在一定區(qū)間內(nèi)呈線性關(guān)系，如果樣本量太大或光路角度沒有最優(yōu)等其他因素導(dǎo)致兩者關(guān)系超出線性范圍，就會對量性判定造成很大誤差。