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【產(chǎn)品名稱】兔抗腦膜炎球菌診斷血清試劑（A、B、C、W、X、Y、多價Ⅰ、多價Ⅱ群）

【產(chǎn)品型號】ZC-NMY-001

【包裝規(guī)格】

【檢測原理與用途】

腦膜炎奈瑟菌是引起流行性腦脊髓膜炎的病原菌，根據(jù)莢膜多糖的結(jié)構(gòu)多樣性腦膜炎奈瑟菌可分為多個血清群。血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)是血清中的抗體會與攜帶同種抗原的細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)，這些抗體是免疫體在接觸細(xì)菌抗原后產(chǎn)生的，本產(chǎn)品中的腦膜炎球菌診斷血清均免疫自實驗兔。本試劑主要用于A、B、C、W、X、Y群腦膜炎奈瑟菌血清學(xué)初步鑒定。本產(chǎn)品為體外診斷試劑，適用于玻片凝集試驗。

【貯存條件及保質(zhì)期】

產(chǎn)品于2℃-8℃保存，需避光，自生產(chǎn)之日起保質(zhì)期12個月。

注意：在長時間儲存過程中，有些血清會變得有點混濁。這種情況為正?，F(xiàn)象不會影響結(jié)果，血清可在使用前低速離心或膜過濾(0.45μm)進(jìn)行澄清。

【檢測方法】

1. 本產(chǎn)品在使用前，由冰箱拿出，平衡到室溫后使用。

2. 樣品分離培養(yǎng)物，經(jīng)鑒定確定為腦膜炎奈瑟菌后，再進(jìn)行血清分群檢測，如果未能確定為腦膜炎奈瑟菌，不宜直接進(jìn)行血清凝集檢測，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

3. 待鑒定細(xì)菌在血平板或巧克力平板上，37℃，5% CO₂，培養(yǎng)18-24小時。

4. 用酒精擦拭載玻片。用蠟筆或防水筆在載玻片上劃格分區(qū)。

5. 在玻片每格的下半部分，用移液器滴加5%的福爾馬林溶液10μL（基于生物安全目的），用無菌或一次性10μL接種環(huán)挑取BAP平板上過夜培養(yǎng)的新鮮菌落，在玻片上將細(xì)菌與5%的福爾馬林溶液混勻，混勻后的液體應(yīng)該不透明，在加抗血清前應(yīng)保持細(xì)菌懸液不干燥。

6. 在玻片的上方加10μL血清群特異的抗血清，同時在陰性對照側(cè)加PBS或者生理鹽水。

7. 也可滴加20μL抗血清在玻片上，挑取新鮮菌落直接與抗血清進(jìn)行混勻，觀察凝集反應(yīng)。（如采用非滅活菌進(jìn)行凝集，操作嚴(yán)格遵守生物安全操作規(guī)范，在BSL-2級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作）。

8. 緩慢的混合細(xì)菌懸液和抗血清，使上部的抗血清和下部的細(xì)菌懸液充分混合5分鐘。不要做旋轉(zhuǎn)晃動，以免不同血清群的血清會相互混合污染。

9. 在燈光下，黑暗背景條件下5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。如果超過5分鐘，才發(fā)生的凝集反應(yīng)按陰性處理。

10. 建議待檢細(xì)菌先分別與多價I和多價II抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，如與多價I出現(xiàn)凝集反應(yīng)陽性，再分別再與A、B、C三個群特異抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)；如與多價II出現(xiàn)凝集反應(yīng)陽性，再分別再與W、X、Y三個群特異抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)。

【檢驗結(jié)果的解釋】

當(dāng)抗血清與細(xì)菌接觸，會引起凝集反應(yīng)，使細(xì)胞（細(xì)菌）凝集或呈簇，細(xì)胞（細(xì)菌）上清液變得清亮，細(xì)胞懸液濃度或使用的抗血清濃度不同，會產(chǎn)生不同的強(qiáng)度的凝集反應(yīng)，見圖示

4+ 所有的細(xì)胞都發(fā)生凝集，細(xì)胞懸液清亮。

3+ 75%的細(xì)胞發(fā)生凝集，細(xì)胞上清略微渾濁不清。

2+ 50%的細(xì)胞發(fā)生凝集，細(xì)胞上清略微渾濁不清。

1+ 25%的細(xì)胞發(fā)生凝集，細(xì)胞上清略微渾濁不清。

+/- 少于25%的細(xì)胞發(fā)生凝集，可見有顆粒狀的成分。

0 沒有肉眼可見的凝集，上清懸液渾濁、平滑。

【血清群確定】

1. 5分鐘內(nèi)，出現(xiàn)3+或4+凝集為陽性反應(yīng)（強(qiáng)陽性反應(yīng)）。對于B群腦膜炎奈瑟菌來說，如果出現(xiàn)2+及以上的凝集則可認(rèn)為陽性。

2. 陰性反應(yīng)是+/-、1+凝集程度。

3. 當(dāng)菌株僅與一種抗血清出現(xiàn)凝集，但和生理鹽水不凝集時才能鑒定為該種血清群。

4. 如果不能確定血清群，菌株記為不可分群腦膜炎奈瑟菌（NG）。

5. 關(guān)于不可分群腦膜炎奈瑟菌（NG）菌株:

1)在生理鹽水中凝集，無論與任何一種抗血清發(fā)生強(qiáng)凝集，記為NG。

2)在生理鹽水中不凝集，但和多種抗血清發(fā)生凝集，記為NG。

3)在生理鹽水中不凝集，也不和任何一種抗血清發(fā)生凝集，記為NG。

【結(jié)果難以判斷時的解決方案】

由于腦膜炎奈瑟菌生長狀態(tài)存在差異性，例如有莢膜與無莢膜，小菌落與大菌落，慢生長與快生長等，有時候可能造成凝集結(jié)果難以判斷，建議可進(jìn)行如下補(bǔ)充操作：

l 挑取同一平板上的另一個細(xì)菌克隆進(jìn)行重復(fù)凝集試驗。

l 如果玻片上的結(jié)果不明確，將試管中配置懸液，重復(fù)該試驗。

l 提取單個菌落轉(zhuǎn)鐘，再次做純培養(yǎng)，第二天重新進(jìn)行凝集試驗。

l 如果當(dāng)天的平板上由各種大小不一的菌落，每種菌落再次分離純培養(yǎng)，第二天每種菌落進(jìn)行試驗，大菌落一般會有比較好的凝集反應(yīng)，小菌落次之，

如果試驗中的問題還是不能解決，應(yīng)當(dāng)和對照菌株同時進(jìn)行試驗，確保試劑的正確性。

【血清質(zhì)量控制】

在對未知的菌落進(jìn)行血清分群之前，應(yīng)選用一套腦膜炎奈瑟菌參考菌株（A、B、C、W、X、Y）和一株可分群的腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行質(zhì)量控制檢測，操作步驟：

1. 新購進(jìn)的每一批次抗血清要用參考菌株進(jìn)行檢測。

2. 半年后重復(fù)質(zhì)量控制檢測。

3. 如果血清長時間暴露于超過10℃環(huán)境，或者懷疑血清被污染時，也要對血清進(jìn)行重新的質(zhì)量控制檢。

4. 關(guān)于血清分群和質(zhì)量控制，每一批次的抗血清需要使用所有的參考菌株進(jìn)行實驗室驗證，記錄質(zhì)量控制驗證結(jié)果。

【血清質(zhì)量控制檢測結(jié)果判讀】

1. 通過質(zhì)量控制檢測：與同源性的抗原反應(yīng)，5分鐘內(nèi)，出現(xiàn)3+或4+程度的凝集；單一血清群的抗血清不與其它血清群的腦膜炎奈瑟菌反應(yīng)，不與已明確的NG菌株產(chǎn)生凝集反應(yīng)，鹽水不自凝。

2. 分群血清質(zhì)量控制檢測失?。喝绻寡迮c一種或多種參考菌株凝集反應(yīng)，或/和NG參考菌株反應(yīng)，鹽水自凝，則血清不能使用。

【注意事項】

1. 僅供科學(xué)研究使用。

2. 全部樣本、微生物培養(yǎng)物和接種產(chǎn)品都應(yīng)該視為具有感染性，由受過訓(xùn)練的技術(shù)人員操作。在整個操作中，應(yīng)該遵循無菌操作技術(shù)和常規(guī)處理菌群的注意事項。

3. 操作過程中不慎有血清灑出，應(yīng)立即用吸水紙擦拭可能污染的區(qū)域，并用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌消毒劑或70%的酒精擦洗污染區(qū)域。用于清潔溢出物的所有材料，應(yīng)作為生物危險廢物處理。

4. 非一次性器具在使用后應(yīng)在121℃下高壓至少15分鐘。一次性器具應(yīng)高壓滅菌或焚燒處理。

5. 不要使用超過有效期及不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定顏色的診斷血清。避免抗血清的微生物污染，會導(dǎo)致產(chǎn)品失效出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

6. 使用前，血清應(yīng)平衡到室溫。同時避免血清冷凍，反復(fù)凍融會使血清產(chǎn)生沉淀。

7. 如出現(xiàn)玻璃瓶破損、變形或包裝損壞的情況，不要使用該試劑。